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干包体植入对救治病患元素泵和钙化泵活性的制约

   日期:2019-11-09     来源:互联网    作者:admin    浏览:5    评论:0    
核心提示:    1我们的研究发现,经冠状动脉灌注分别移植自体骨髓单个核细胞( BMCs)、骨髓间充质干细胞( MSCs)对心功能均产生了有

  

  1我们的研究发现,经冠状动脉灌注分别移植自体骨髓单个核细胞( BMCs)、骨髓间充质干细胞( MSCs)对心功能均产生了有益的影响,其中以BMCs移植对心功能的改善作用为明显,其次是M SCs.SMs移植虽然没有导致心功能的改善,但有抑制了心功能恶化的趋势。

  三种干细胞移植虽然未能逆转或阻止左室重构的恶化,但延缓了左室重构的进展。

  我们的前期研究发现,不论是BM Cs、MSCs,还是SMs移植都仅能延缓、并不能逆转甚至阻止左室重构的进一步恶化。心肌内存活的移植细胞,包括分化形成的心肌细胞分布稀疏,没有与周围心肌组织形成器官化三维结构的现象,不可能提供有效的收缩。因此,心脏细胞移植治疗CHF的机制除了移植细胞本身或其分化形成的心肌细胞提供有限的收缩以外,可能尚有其它机制的参与。

  在CHF的病理生理过程中, Ca2+调节的改变是各种机制的中心环节。在参与Ca2+循环的各种Ca2+调节蛋白中,肌浆网Ca 2+ATP酶( SERCA )、钠钙交换体( NCX)和心肌细胞膜Na +-K + AT P酶( CM NKA)的蛋白水平和活化程度是细胞内Ca 2+稳态的决定性因素。人与动物的心衰模型已经证实, CHF时SERCA和CM NKA的表达水平下调,功能受损, NCX的表达水平不变或代偿性增加,Ca2+摄取下降,降低了心肌收缩力。通过转基因技术使SERCA2过表达可以明显增强心肌收缩力,改善CHF动物模型的血流动力学状态。因此,CMNKA和SERCA,尤其是SERCA活性的增强可能参与了心脏细胞移植以后衰竭心肌收缩和舒张功能的改善。

  本研究拟采用非选择性冠状动脉灌注的方法,分别移植三种不同类型的自体干细胞: BM Cs、M SCs和SM s治疗兔阿霉素性心肌病,比较这三种不同类型的干细胞移植对心室肌CMN KA和SERCA活性的影响,以探索干细胞移植治疗CHF的机制。

  2材料与方法

  2. 1实验材料

  2. 1. 1主要试剂BrdU ( Sigma) , DAPI( Roche) ;DMEM、胎牛血清( Gibico) ; CM NKA和SERCA活性检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)及国产分析纯试剂。

  2. 1. 2主要仪器CO2

  培养箱( SANYO) ;倒置相差显微镜( OLYM PU S) ;低温离心机、低温超速离心机( Beckman) ;数字减影心血管造影机( Simens AXIOM ) ;彩色多普勒超声心动图仪( HP4500) ;分光光度计(上海实验仪器三厂)等。

  2. 1. 3实验动物日本大耳白兔,体重2. 0~2. 5 kg,由四川大学华西基础医学院实验动物站提供。

  2. 2实验方法

  2. 2. 1非缺血性心肌病CHF动物模型的建立选用日本大耳白兔。将阿霉素(浙江海正药业)用生理盐水稀释,以2. 5 mg/ kg/ w经兔的耳缘静脉推注,连续八周,再四周后进行下一步试验。对照组采用等量的生理盐水静脉推注。分批建立动物模型。

  2. 2. 2实验分组CHF动物模型建立以后,按随机数字表法随机分为四个组: CHF+假手术组(假手术组) , CHF+ BM Cs移植组( BMCs组) , CHF + M SCs移植组( MSCs组) , CHF+ SMs移植组( SM s组)。

  2 . 2. 3干细胞的分离、培养和标记BM Cs参照我们既往采用的方法分离获取BMCs,加入含20 mol/ L BrdU、10小牛血清和5胎牛血清的DM EM培养液中,吹打,制成细胞悬液。在37℃,5 CO2培养箱中培养过夜。次日收集细胞,无血清DM EM洗涤两次,加入含100 U / ml肝素的无血清DM EM 10 ml,制成单细胞悬液以备移植,细胞总量约107个。M SCs和SMs参照我们既往采用的方法分离培养M SCs和SMs.当细胞数量达到107个左右时,改用含20 mol/ L BrdU、10小牛血清和5胎牛血清的DMEM培养过夜。次日收集细胞,无血清DM EM洗涤两次,加入含100 u/ ml肝素的无血清DM EM 10 ml,制成单细胞悬液,以备移植。

  2. 2. 4干细胞移植参照我们既往采用的方法

  进行干细胞移植。

  2. 2. 5心功能检测心脏彩色多普勒诊断仪,超声探头频率8 M Hz.在阿霉素使用12周后和干细胞移植4周后测定左室射血分数( LVEF)。

  2. 2. 6心肌细胞膜的制备参照文献< 6>的方法提取心肌细胞膜。置0℃中保存,于48 h内测CM NKA活性。

  2. 2. 7心肌肌浆网( SR)膜提取方法肌浆网的提取依照文献的方法进行。- 70℃保存待用。

  2. 2. 8心肌细胞膜和SR膜纯度的鉴定分别测定正常对照组心肌细胞质膜标志酶Na + -K + AT P酶、SR标志酶葡萄糖-6-磷酸酶和线粒体细胞色素C氧化酶活性,以鉴定膜的纯度。

  2. 2. 9CMNKA和SERCA活性的测定分别取2上述组织匀浆100 l,用考马斯亮兰蛋白测定法测定组织蛋白含量,严格按说明书操作测定CMNKA和SERCA活性。原理: AT P酶分解ATP生成ADP及无机磷,通过测定无机磷判断AT P酶活力的高低。ATP酶活力单位以每小时分解每克组织蛋白( g Protein )产生的无机磷( pi)的含量( mmol)来表示,即molPi/ mgprot/ hour.

  2. 2. 10统计学方法采用SPSS 10. 0软件包进行统计学分析;所有计量资料由x -±s表示,健康对照组与假手术组的ATP酶活性用成组t检验;多组间两两比较用LSD法分析。相关性采用Pearson相关性分析。P< 0. 05为有统计学意义。

  3结果

  3. 1肌细胞膜和SR膜的纯度

  所提取的正常对照组心肌细胞膜和肌浆网膜,其标志酶活性明显高于非标志酶活性,表明所分离提取的膜纯度较高(见1)。

  3. 2CHF兔LVEF、心肌CMNKA活性和SERCA活性的变化

  CHF兔LVEF、CM NKA活性和SERCA活性明显减低,差异有统计学意义( P< 0. 05)。相关性分析显示, LVEF与CM NKA活性没有相关( r = 0. 261, P= 0. 330) ,与SERCA活性呈正相关( r为0.

  550, P= 0. 027) (见)。

  3. 3不同类型的干细胞移植后LVEF、CMNKA及SERCA活性的变化

  不同类型的干细胞移植后CM NKA活性均明显改善( P分别小于0. 05、0. 01和0. 01) , SM s组CM NKA活性高于BMCs组和MSCs组( P分别小于0. 01和0. 05) , BM Cs组与M SCs组间差异无统计学意义( P> 0. 05)。干细胞移植各组SERCA活性有改善的趋势,但与假手术组相比,差异无统计学意义( P均大于0. 05) ,各移植组间差异无统计学意义( P均大于0. 05)。相关性分析显示, Sham组及各移植组内LVEF与SERCA活性具有正相关性( r分别为0. 904、0. 734、0. 729和0. 879, P分别为0. 002、0. 038、0. 021和0. 03)。M SCs组LVEF与CM NKA活性呈正相关( r为0. 729, P为0. 04) (见2)。

  4讨论

  本研究结果显示,阿霉素性引起的CHF的CMNKA活性和SERCA活性明显降低, LVEF与SERCA活性呈正相关,心功能越差, SERCA活性越低,不同类型的干细胞移植后,心肌CM NKA活性均明显改善, SERCA活性也显现了改善的趋势。

  说明,不论是骨髓源性干细胞( BM Cs、MSCs)移植,还是SMs移植,均能够改善CM NKA活性,并具有改善SERCA活性的趋势,干细胞移植后的LVEF与SERCA活性具有正相关关系,说明CMN KA ,特别是SERCA活性的改善与干细胞移植后,尤其是与BMCs、M SCs移植后心功能的改善有明显关系。

  干细胞移植所导致的CM NKA和SERCA的改善有利于胞内Na+浓度的恢复,提高NCX驱动力,有利于Ca2+瞬变时间的缩短和幅度的增加,终增加心肌收缩力,改善心功能。

  干细胞移植改善CM NKA和SERCA的机制目前尚不十分清楚。研究发现,骨髓源性干细胞分化形成的心肌细胞能够表达受磷蛋白,其Ca2+瞬变也与原有的心肌细胞同步。因此,移植细胞本身(肌细胞)和/或其(骨髓源性干细胞)分化形成的心肌细胞自身含有功能正常的CM NKA和SERCA,可能改善了干细胞移植后心肌CM NKA和SERCA活性。然而,本研究部分发现,移植细胞在心肌组织中所占比例很低, BMCs、M SCs分化形成的心肌细胞更低,其所拥有的CM NKA和SERCA活性能否改善心室肌组织中CM NKA和SERCA的活性令人怀疑。

  已有的研究显示,不论是体外培养还是移植到心肌内,很多骨髓细胞亚群均通过自分泌或/旁分泌的方式释放一些生血管和生长因子,扮演了支持细胞的角色,改善了心肌内微环境。这些生血管和生长因子包括血管内皮生长因子( VEGF)和单核细胞趋化蛋白-1 ( M CP-1)、成纤维细胞生长因子( FGF)、血管生成素-1、、胎盘生长因子、胰岛素样生长因子( IGF-1)、干细胞衍生因子( SDF-1)、基质金属蛋白酶-9( M M P-9)、肝细胞生长因子( HGF)、纤溶酶原激活剂、粒细胞集落刺激因子( G-CSF)和粒-巨噬细胞集落刺激因子( GM -CSF)等。除了骨髓细胞能够分泌细胞因子以外, SMs也能够通过自分泌或/旁分泌的方式释放IGF-1等细胞因子,其分泌随负荷增加而增加。由于这些细胞因子在移植细胞的生存、增殖、分化、以及血管生成、外周血骨髓源性干细胞的归巢中具有重要的作用。因此,可以设想,干细胞移植以后,心肌内存活的移植细胞发挥其作为支持细胞的作用,释放细胞因子,改善了衰竭心肌内环境,一方面促进了移植细胞的增殖、分化和血管生成,抑制了心肌细胞的凋亡,阻止左室重构的恶化,另一方面,由于心肌内环境的改善,衰竭心肌细胞的能量代谢也得到了改善,从而改善了心室肌CM NKA和SERCA的活性。上述机制可能共同促进了心室肌CM NKA和SERCA活性的增强和心功能的改善。

  但是,本研究发现,与SM s相比, BM Cs和M SCs移植能够更好地改善心功能,但其增强CM NKA和SERCA活性的效应却不如SM s明显,显示干细胞移植增强心功能的机制,除了与其增强CM NKA和SERCA活性有关以外,尚有其它因素的参与,还需要进一步的研究。

  综上,本研究发现,不论是BM Cs、MSCs移植,还是SM s移植,均能够改善CMNKA活性,并具有改善SERCA活性的趋势,干细胞移植后的LVEF与SERCA活性具有正相关关系。说明CM NKA,特别是SERCA活性的改善可能是干细胞移植治疗CHF的机制之一。

 
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